Аллергические болезни     |     Иммунологические методы

Методы сбора аллергенных частиц

Для больных, сенсибилизированных к аэроаллергенам, а также для врачей важное значение имеют сведения о содержании в воздухе аллергенных частиц в определённом регионе в конкретный день сезона. Больные, информированные о сроках появления пыльцы амброзии или спор грибов рода Alternaria, могут предупреждать обострение заболевания. Для идентификации и определения количества частиц в воздухе применяют различные методы сбора и подсчёта. Покровное стекло или любую другую прозрачную поверхность с нанесённым на неё клейким веществом оставляют на воздухе, а затем под микроскопом подсчитывают осевшие и прилипшие пыльцевые частицы и споры. Для уменьшения вероятности ошибок, вызванных различиями в размерах частиц, скоростью ветра и дождём, используют различные приспособления. Подсчёт спор грибов проводят также с использованием культуральной техники. Более подробно о методах сбора и подсчёта можно прочитать в специальных обзорах [11-13]. Несмотря на внедрение различных иммунологических методов идентификации и количественного анализа, методом выбора остаётся микроскопическое исследование аэроаллергенов. Основными типами приборов для сбора и подсчёта частиц являются гравитационные, волюметрические и всасывающие коллекторы.

Гравиметрические сборники

Первыми для оценки количества пыльцы в воздухе начали применять гравиметрические приборы. Их преимуществом является простота использования и невысокая стоимость. Прототипом этих устройств является прибор Дюрама (Durham), состоящий из пары параллельных круговых пластинок по 7,5 см в диаметре. Подготовленное предметное стекло помещают на 24 ч на подставку в 2,5 см над нижней пластинкой. Затем препарат окрашивают (применяют, как правило, спиртовой раствор основного фуксина), под микроскопом идентифицируют и подсчитывают пыльцевые зёрна и споры грибов. Краситель увеличивает размеры пыльцевых зёрен и окрашивает их в красный цвет. Подсчитывают число зёрен на 1 см2 поверхности. Другая методика заключается в подсчёте числа зёрен пыльцы на покровном стекле размерм 22x22 мм) с последующим умножением на коэффициент 4,84, что отражает содержание частиц в 1 см2. Этот метод скорее качественный, чем количественный, так как, во-первых, результат зависит от скорости ветра и места расположения прибора, во-вторых, практически невозможно определить объём исследуемого воздуха. Таким образом, несмотря на исторические заслуги приборов этого типа в аэробиологии, их используют всё реже.

Сборники пыльцы ударного типа

Наиболее распространёнными устройствами для сбора и анализа пыльцы являются вращающиеся коллекторы ударного типа. Принцип их действия заключается в том, что скорость ветра всегда превышает скорость гравитационного оседания частиц. Переносимые ветром частицы небольшого размера под действием инерционной силы сталкиваются в приборе с липкой поверхностью. Если диаметр этой поверхности мал (от одного до нескольких миллиметров), то возникающие небольшие завихрения отклоняют частицы. Таким образом, наименьшие из атакуемых поверхностей имеют наибольшую вероятность попадания на них частиц. Вращающийся сборник частиц состоит их двух вертикальных собирающихся рычагов, поднятых на крестовину и вращаемых вертикальной осью мотора. Скорость вращения приближается к нескольким тысячам оборотов в минуту и почти не зависит от скорости ветра. Пластичные собирающиеся поверхности покрыты слоем липкого силикона. Эти сборники частиц обычно работают в прерывистом режиме (от 20 до 60 с каждые 10 мин) до заполнения. Одна из используемых моделей приведена на рис. 6-1 (см. на вклейке). Этот прибор обладает более чем 90% эффективностью при улавливании частиц пыльцы диаметром около 20 мкм.

Сборники пыльцы всасывающего типа

Всасывающие приборы используют для втягивания воздушных образцов вакуумный насос. Приборы этого типа чаще применяют для учёта частиц малого размера, таких, как споры плесневых грибов, хотя они подходят и для улавливания пыльцы. На захватывание частиц различных размеров существенное влияние оказывают направление и скорость ветра. Так, если скорость ветра ниже, чем создаваемая при всасывании в сборник, частицы мельчайшего размера собираются в концентрациях, превышающих их содержание в окружающем воздухе. При больших скоростях ветра происходит обратное. Спороуловитель Хирста (Hirst) всасывающий сборник частиц с часовым механизмом, в котором липкий слой движется вдоль всасывающего отверстия, что даёт возможность различать суточные вариации содержания. Ветер ориентирует прибор по направлению потока. Спороуловитель Буркхарда (Burkhard) собирает частицы на липкий слой барабана, делающего полный поворот вокруг всасывающего отверстия за одну неделю. Оба варианта споровых ловушек предназначены для нежизнеспособного материала, они удобны для улавливания частиц самого различного размера. Прибор Андерсона (Anderson) ещё один волюметрический сборник, его отличает возможность улавливать жизнеспособные грибные споры. Воздух проходит через серию ситоподобных пластин (либо 2, либо 6), каждая из которых имеет по 400 отверстий. По мере продвижения воздуха от пластины к пластине диаметр отверстий уменьшается. Под каждой пластиной располагаются чашки Петри с питательным раствором. Наиболее крупные частицы задерживаются верхними, а мелкие нижними пластинами. Споры, прошедшие через отверстия, попадают на агар, в последующем формируя колонии. Этот метод применяют для идентификации грибов, морфологические особенности спор которых не позволяют идентифицировать их при микроскопировании. В целом сбор нежизнеспособных материалов технически более точно отражает действительное соотношение количества спор сравнительно с культуральными методами. Объём воздуха, прошедший через всасывающий прибор в спокойных условиях, легко просчитывается, поскольку вакуумный насос обычно откалиброван. Для вращающихся ударных сборников пыльцы существуют специальные формулы, учитывающие площадь реагирующей поверхности, скорость вращения и время экспонирования, так что после окрашивания и подсчёта частиц их количество может быть представлено в виде содержания частиц в определённом объёме воздуха (обычно в 1 м3). При проведении исследований по подсчёту количества пыльцы и спор очень важно правильно расположить прибор. Наземное положение обычно нежелательно. Наиболее часто сборники размещают на крышах зданий, по крайней мере в 6 м от различных препятствий и на 90 см выше парапета крыши. Хорошие результаты при использовании в пыльцевых коллекторах показали такие липкие вещества, как силиконовая смазка (Sampling Technologies, Minnetonka, MN), бензиновая смазка (А.Н. Thomas, Philadelphia); резиновый клей, силиконовое масло и глицерин менее надёжны, так как их свойства изменяются в зависимости от влажности и температуры.

Подсчёт спор грибов кулыпуралъным методом

Наряду с гравитационными и другими описанными выше методами исследование спор грибов проводят путём культивирования. Споры многих видов грибов в связи с большим сходством не могут быть идентифицированы морфологически, что требует исследования колоний грибов в культуре. Для этого покрытые питательной средой чашки Петри оставляют открытыми в течение 530 мин, а затем инкубируют в течение 5 дней при комнатной температуре, после этого окрашивают и подсчитывают число и тип проросших колоний. Рост большинства аллергенных грибов поддерживает картофельно-декстрозный агар, куда для подавления роста бактерий и чрезмерного распространения грибковых колоний добавляют антисептик. Для исследования некоторых видов грибов (например, Aspergillus или Penicillium) применяют специальные среды (например, среду Чапека). К основным недостаткам метода культивирования на чашках Петри относится значительная недооценка количества спор, устраняемая при использовании насосных приспособлений (например, приборов типа Anderson или Burkhard, см. выше). Содержащие большое количество спор микроконидии часто дают рост только одной колонии. Возможно также взаимное угнетение или избыточный рост одной колонии, как это бывает у Rhizopus nigricans. Другим недостатком культивирования является короткий период времени для забора материала, а также то, что некоторые грибы не растут на обычно используемых средах.